การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีย์ต่อเอ็นซัยม์ Plasmodium lactate dehydrogenase เพื่อใช้วินิจฉัยโรคมาลาเรีย

บทคัดย่อ

มาลาเรียยังคงเป็นปัญหาสาธารณสุขของประเทศไทย โดยเฉพาะท้องที่ห่างไกลและทุรกันดารบริเวณชายแดนของ ประเทศ มาตรการที่สำคัญที่สุดในการควบคุมไข้มาลาเรียในสถานการณ์แบบนี้คือ การให้บริการตรวจและรักษาอย่างรวดเร็ว การประยุกต์ใช้ชุดตรวจหาเชื้อมาลาเรียอย่างรวดเร็วที่เรียกกันง่าย ๆ ว่า dipstick เมื่อนำมาใช้เสริมวิธีตรวจปกตินับว่าเป็น มาตรการที่ดีและเหมาะสมมาตรการหนึ่ง แต่ปัญหาสำคัญคือ dipstick ในปัจจุบันมีราคาแพงและไม่สามารถควบคุมคุณภาพได้ เนื่องจากเป็นเทคโนโลยีที่ซื้อมาจากต่างประเทศ ดังนั้นความพยายามที่จะผลิต dipstick ได้เองในประเทศไทยจึงเป็นสิ่งจำเป็น การผลิต dipstick เริ่มต้นจากการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีย์ที่มีความไวและความจําเพาะสูงต่อเชื้อมาลาเรีย ผู้วิจัยเลือก Plasmodium lactate dehydrogenase (pLDH) เป็นแอนติเจนที่จะนำมาใช้ผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีย์ เนื่องจากเป็นโปรตีน ที่จำเพาะต่อเชื้อมาลาเรียที่มีชีวิตอยู่ และถูกผลิตออกมาเป็นจำนวนมากในร่างกายผู้ป่วยที่กำลังติดเชื้อมาลาเรีย ขั้นตอนการผลิต โมโนโคลนอลแอนติบอดีย์เริ่มจากการเตรียมแอนติเจนซึ่งมาจาก 2 แหล่ง คือจากโปรตีนธรรมชาติและโปรตีนสังเคราะห์ ในส่วน ของโปรตีนธรรมชาติได้จากการสกัดโปรตีน pLDH จากเชื้อมาลาเรียสายพันธุ์ K1 ที่เลี้ยงในหลอดทดลอง แล้วนำมาผ่าน Cibacron blue column ส่วนโปรตีนอีก 2 ตัวเป็นโปรตีนสังเคราะห์ คือ pLDH-GST และ pLDH-His นำโปรตีนฉีดเข้าหนู BALB/c mices 3 กลุ่ม แบ่งตามที่มาของแอนติเจนดังกล่าว จากนั้นนำ mouse spleen มา fuse กับ myeloma cell line ทำ cloning แล้วเลือก hybridoma cells ที่ผลิตแอนติบอดีย์ต่อ pLDH โดยใช้วิธีคัดกรอง 2 วิธี คือ ELISA และ Dot-ELISA จากนั้นเลือกโมโนโคนอล แอนติบอดีต่อเชื้อ Plasmodium falciparum และ PAN malaria antigen โดยวิธี indirect immunofluoresent assay (IFA), SDS-polyacrylamide gel electrophoresis และ Western blot analysis พบว่าโมโนโคลนอลแอนติบอดีย์ส่วนใหญ่ ได้มาจากการใช้โปรตีนสังเคราะห์ จำนวนโคลนที่ได้รวมทั้งสิ้น 269 โคลน แต่เป็นโคลนที่แข็งแรงและคงทน 118 โคลนซึ่งได้ จากโปรตีนธรรมชาติ 1 โคลน โปรตีนสังเคราะห์ pLDH-GST 35 โคลน และโปรตีนสังเคราะห์ pLDH-His 63 โคลน แต่จากโคลนที่ผลิตจากกลุ่มที่ 1 และ 2 เป็นชนิด IgM จึงต้องเปลี่ยน immunoglobulin class ของกลุ่มที่ 2 บางโคลนจาก IgM เป็น IgG เพื่อสะดวกต่อการนํามาเชื่อมกับ colloidal gold ให้ได้โคลนที่แข็งแรงและคงทนจำนวน 19 โคลน เมื่อวิเคราะห์ ความจำเพาะโดยวิธี IFA และ Western blot ได้โมโนโคลนอลแอนติบอดีย์ที่จําเพาะต่อเชื้อ P. faciparum 61 โคลน จําเพาะต่อ เชื้อ P. vivax 15 โคลน และจำเพาะต่อ PAN malaria species 33 โคลน โคลนที่นำมาผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีย์ ส่วนใหญ่ตรวจหาเชื้อมาลาเรียได้ต่ำสุด 312 ตัวต่อไมโครลิตร ในขั้นตอนต่อไปจะเลือกบางโคลนนำไปผลิต dipstick ต่อไป